流式細胞術作為一項生命科學領域的重要技術，想要使用好自然是不容易。相信不少小伙伴在使用幾次之后，還是會有云里霧里的感覺。真正想掌握好一門技術，還是得從基礎部分就做好。話不多說，直接上干貨！

1 如何搭配流式抗體熒光標記？

流式抗體熒光標記搭配主要由3個因素決定：流式細胞儀能檢測多少個通道、需要同時檢測多少個指標、廠家的抗體有多少種熒光標記。流式細胞儀的通道越多，那么同一份樣本能同時檢測的表面/胞內/核內蛋白就越多。

以Calibur為例說明：Calibur的FL1通道選擇了FITC就不能選擇AlexaFluro488，或者選擇了Alexa Fluro488就不能選FITC；Calibur的FL3通道盡管能檢測PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7五個熒光素，但是我們搭配的時候只能選擇其中1個。

如果流式細胞儀能做4個通道，在第1個原則之下，那么每個通道隨便選出1個熒光素就可以組合成4個顏色。以2根激光的Calibur為例，如常用的搭配是FITC(FL1)＋PE（FL2）＋PerCP（FL3）+APC(FL4), 這個搭配組合可以更改成Alex Fluro488(FL1)＋PE（FL2）＋PerCP（FL3）+APC(FL4), 或者FITC(FL1)＋PE（FL2）＋PerCP（FL3）+AlexFluro647(FL4)，或者FITC(FL1)＋PE（FL2）＋PE- Cy5（FL3）+APC(FL4)等多種組合。總之，在第原則之下，我們可以隨意搭配和組合各個熒光素。但是需要注意的是，APC和PE-Cy5一起使用的話，容易導致補償度，因此，通常我們不會將這兩種熒光素一起使用，即使他們不在同一通道檢測。

流式細胞儀有哪些激光

比如，標配的FACSCalibur只有一根488nm的激光，能做FL1、FL2、FL3三個熒光通道/三個顏色，而選配的Calibur (FACSCalibur的簡稱)配有488nm和635nm兩根激光，可以檢測FL1-FL4四個通道/4個顏色。不同型號的流式細胞儀的同樣的一個通道檢測熒光素的能力不一樣比如Calibur的FL3（第3通道）能檢測PE-TexasRed, PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5.5,PE-Cy7,而FACSAria的第3 通道只能檢測PE-Texas Red,PE-Cy5, PerCP。Calibur第3通道能檢測的PerCP-Cy5.5在FACSAria上是第4通道檢測。Calibur和LSR都能檢測4個顏色，但是第4個通道檢測的熒光素是不一樣的。

3 如果檢測的指標數目超過了流式細胞儀的通道，怎么辦？

如果需要做5個指標，而流式細胞儀只能做4個通道，首先將指標歸成2類，再將樣本分成2份，分別檢測。比如需要同時檢測CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma，可以將樣本分成兩份，第1份加CD3、CD4、CD8 和IL-4，而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。具體的歸類方式可根據課題的設計來進行。

4 流式檢測樣本如何保存？

全血樣本：一般來說，血液樣本必須在6個小時內處理，晚不得超過12小時；做完染色后，需要放在多聚甲醛中保存，一般可以存放3天左右。培養細胞樣本：培養的細胞可以用多聚甲醛保存。做DNA倍體的樣本：將樣本保存在70%的乙醇中，并適量加入血清，-70℃冰箱保存，可以幾個月內檢測。

5 抗體染色的細胞不能立即檢測該如何處理？

如果實驗對細胞活性要求比較高，如凋亡實驗，必須盡快檢測；

如果實驗對細胞活性要求不高，可以使用含有4%多聚甲醛的PBS固定樣本30分鐘，固定后的細胞4℃過夜保存，次日檢測。

6 同型對照的作用是什么？

抗體有時會和非抗原結合，可能會因為非特異的蛋白-蛋白相互作用結合細胞內成分，因為疏水作用結合脂肪，也可能會結合一些細胞表面表達的抗體受體。比如，IgG亞型的抗體會結合細胞表面的Fc受體，如CD16、CD32和CD64。理想條件下，各種類型的非特異性結合都可以通過蛋白（BSA、牛奶或動物血清）來阻斷。Fc受體的結合則可以通過與含免疫球蛋白的血清預孵育來阻斷。一個抗體非特異性相互作用和受體結合的情況，可以用無關抗原的相同亞型抗體來比照。

7什么時候需要使用同型對照？

做胞內流式實驗：比如胞內細胞因子、趨化因子和信號蛋白等。

表面標志特異性不高或者不常見的： 一些特異性不高的抗體，如多抗，非特異性結合非常多，使用同型對照可排除假陽性； 因為不熟悉不常見標志的表達情況，根據同型對照可以判斷陽性細胞的位置。對流式非常熟悉，且檢測的是CD3、CD4、CD19等表達強度非常高的標志，可以不使用同型對照。

8怎樣選擇同型對照？

一般選擇與一抗的成分相同種屬來源、相同亞型和亞鏈、相同熒光標記的抗體：

比如抗人的CD56 FITC標記的抗體，亞型是Mouse IgG1,κ，那么它的同型對照應該是FITC標記的Mouse IgG1,κ。

如果是抗體的組合形式，純化的一抗＋熒光標記的二抗，那么應該選擇一抗的同型對照：

比如CD86的純化抗體，亞型是Mouse IgG1,κ，二抗是PE標記的抗小鼠IgG1，那么它的同型對照是純化的Mouse IgG1,κ。染色方式如下：樣本管，純化的CD86＋PE標記的抗Mouse IgG1(二抗)＋樣本；同型對照管，純化的同型對照＋PE標記的抗Mouse IgG1(二抗)＋樣本。如果沒有找到適合的同型對照，在保持來源相同、熒光標記相同、免疫球蛋白類別相同條件下，優先選擇的順序是亞鏈不同--亞型不同--相同類別,比如，某抗體的來源是Mouse IgG2а,κ。如果在同型對照表里找不到相同的同型對照，那么優先選擇相同熒光標記Mouse IgG2а為同型對照；如果也沒有找到Mouse IgG2а，那么優先選擇相同熒光標記的Mouse IgG2b作為同型對照；如果后還是沒有找到Mouse IgG2b，那么選擇相同熒光標記的Mouse IgG2作為同型對照。

9為什么有時候同型對照的表達會比抗體的表達高？

首先需要檢查同型對照是否加錯類型、劑量等。其次，因為有些標志在流式細胞術的表面或者胞內表達不高，而跟其類似的抗原非常多，那么加入同型對照時，同型對照非特異性的結合會超過抗體的特異性，所以會造成這種現象。這個時候推薦使用其他陰性對照，如空白對照等。